Ⅱ相代謝穩(wěn)定性研究原理及實(shí)驗(yàn)方法

1 概述

1.1 藥物代謝研究簡(jiǎn)介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關(guān)重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低，代謝產(chǎn)物的檢測(cè)具有一定的困難。體外代謝法在短時(shí)間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結(jié)果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡(jiǎn)單，代謝過程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，同時(shí)可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實(shí)際工作中應(yīng)用較為普遍。

1.2 藥物代謝

藥物代謝，又稱藥物的生物轉(zhuǎn)化（biotransformation），是指藥物經(jīng)過體內(nèi)吸收、分布之后，在藥酶的作用下經(jīng)歷化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的過程，是藥物從體內(nèi)消除的主要方式之一。藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，分為Ⅰ相代謝反應(yīng)和Ⅱ相代謝反應(yīng)。

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機(jī)體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶。UGT家族是人體內(nèi)僅次于CYP450家族的第2大藥物代謝酶。UGT介導(dǎo)的葡萄糖醛酸結(jié)合代謝不僅會(huì)顯著影響藥物的口服生物利用度和藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程，同時(shí)還與一些臨床藥物-藥物相互作用、藥物-草藥相互作用、藥物-食物相互作用，以及高膽紅素血癥、癌癥、自身免疫性肝炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

UGT催化的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體將一分子的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團(tuán)的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的結(jié)合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進(jìn)而更容易被排出體外。

1.3藥物的Ⅱ相代謝

藥物的Ⅱ相代謝，又稱結(jié)合反應(yīng)，是藥物在Ⅱ相代謝反應(yīng)中與一些內(nèi)源性的物質(zhì)（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結(jié)合或經(jīng)甲基化、乙酰化排出體外。藥物的結(jié)合反應(yīng)，常常使其轉(zhuǎn)化為無活性的代謝物，且極性增加，以便藥物排出體外。

藥物的結(jié)合反應(yīng)包括葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸化、乙?；⒓谆?、谷胱甘肽結(jié)合、氨基酸結(jié)合及縮合反應(yīng)等。葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化重要、普遍的結(jié)合反應(yīng)。葡萄糖醛酸基的直接供體是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）（見圖1）。

圖1 葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)

   葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）催化的葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）為葡萄糖醛酸的供體，將一分子的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到含有羥基、羧基、氨基、巰基以及酸性碳原子等基團(tuán)的脂溶性小分子底物上，葡萄糖醛酸和小分子底物的結(jié)合使這些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，進(jìn)而更容易被排出體外。

例（圖2）：

圖2α-D-UDP-葡糖醛酸和異源物的結(jié)合反應(yīng)

例（圖3）：

圖3 苯甲酸的葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)

一般來說，藥物先進(jìn)行Ⅰ相反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如果極性依然較弱，則會(huì)啟動(dòng)Ⅱ相反應(yīng)，但有些藥物可直接進(jìn)行Ⅱ相反應(yīng)。

2 實(shí)驗(yàn)原理

Ⅱ相代謝，又稱結(jié)合反應(yīng)，指Ⅰ相代謝產(chǎn)物或原型藥物在酶的影響下與內(nèi)源性小分子發(fā)生結(jié)合，使藥物毒性、活性降低或極性增加而易于排出的反應(yīng)。在藥物的Ⅱ相代謝中，與葡萄糖醛酸的結(jié)合反應(yīng)常見，由微粒體中的糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）進(jìn)行反應(yīng)，形成葡萄糖苷酸，使其水溶性增加，易于排出體外。因此，在體外，如若加入肝微粒體和UGT系統(tǒng)，便可重建Ⅱ相代謝體系，從而進(jìn)行Ⅱ相代謝穩(wěn)定性研究。

3 肝微粒體體外溫孵法實(shí)驗(yàn)方法描述

肝微粒體體外溫孵法是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在體外模擬生理環(huán)境條件進(jìn)行代謝反應(yīng)，經(jīng)過一定時(shí)間的反應(yīng)后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測(cè)定溫孵液中原型藥物剩余含量的方法。

3.1 肝微粒體制備

微粒體是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實(shí)驗(yàn)中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（圖4）：

圖4 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

Ⅱ相

代謝穩(wěn)定性研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，由微粒體中的糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系。

推薦的孵育體系為：每個(gè)孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂），UGT孵育系統(tǒng)（5 mM UDPGA，5 mM D-葡萄糖二酸-1.4-內(nèi)酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.5 mg/mL的肝微粒體蛋白，合適濃度的待測(cè)物，于37°C水浴孵育，每個(gè)樣品平行3次，將待測(cè)物換為7-羥基香荳素，作為陽性對(duì)照， 陰性對(duì)照組分三組：a.只加UDPGA；b.只加A液、B液；c.不加UDPGA、A液、B液。于預(yù)設(shè)的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，如0，5，10，15，30，60 min后加入等體積預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)。

3.3 原型藥物檢測(cè)

采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測(cè)定溫孵液中原型藥物的剩余含量。

4 智泰康醫(yī)藥Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試劑盒簡(jiǎn)介

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)藥物代謝研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，開發(fā)了一款專門用于Ⅱ相代謝穩(wěn)定性研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物的Ⅱ相代謝穩(wěn)定性研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，符合Ⅱ相代謝穩(wěn)定性研究試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

4.1 產(chǎn)品說明

本產(chǎn)品提供了藥物Ⅱ相代謝研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統(tǒng)、UGT孵育系統(tǒng)及其它組分，可直接用于藥物Ⅱ相代謝穩(wěn)定性的研究。本產(chǎn)品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據(jù)實(shí)際需求，選擇不同種屬的肝微粒體。

4.2 試劑盒優(yōu)勢(shì)

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。

4.3 產(chǎn)品組成

50反應(yīng)/盒，200μL/反應(yīng)。

4.4 產(chǎn)品使用說明

本產(chǎn)品需于-70℃冰箱冷凍保存，切記避免反復(fù)凍融。試驗(yàn)具體操作如下：

4.4.1 試驗(yàn)組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預(yù)孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機(jī)溶劑加入量不得大于1%。

   b.若實(shí)際需要n個(gè)孵育體系，則需配置n＋1個(gè)體系。

3）將以上混合液195μL/管分裝至1.5mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應(yīng)加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動(dòng)代謝反應(yīng)，使用秒表計(jì)時(shí)；

4）于設(shè)定孵育時(shí)間點(diǎn)，向孵育體系中加入200μL預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)（預(yù)冷乙腈：孵育體系體積=1:1）。

4.4.2 對(duì)照組

1）陽性對(duì)照組：將受試物換為陽性底物；

2）陰性對(duì)照組分三組：a.只加UDPGA；b.只加A液、B液；c.不加UDPGA、A液、B液；

3）空白對(duì)照：只包含底物和PBS緩沖液。

4.4.3 運(yùn)輸條件

   干冰運(yùn)輸。

4.4.4 注意事項(xiàng)

1）試驗(yàn)開始前，請(qǐng)自行準(zhǔn)備1.5mL離心管、不同規(guī)格槍頭、乙腈、37℃水浴鍋等。

2）本產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動(dòng)物的治療或臨床診斷。

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻。

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復(fù)凍融。

5）在使用過程中，也可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整各組分的加入量。

6）D-葡萄糖二酸-1.4-內(nèi)酯為葡萄糖醛酸結(jié)合物的水解抑制劑，可根據(jù)實(shí)際需求選擇是否加入。