肝臟是藥物代謝的重要器官，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。其中，原代肝細(xì)胞作為一種肝臟體外模型，因具有較好的體外試驗(yàn)重現(xiàn)性，基本維持了肝臟的代謝功能，特別是較好的保留了與體內(nèi)一致的酶水平，成為了體外藥物試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)"，廣泛應(yīng)用于藥物代謝與毒理學(xué)等研究中。原代肝細(xì)胞分離常用的方法有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法和兩步膠原酶灌流法等。其中，兩步膠原酶灌流法因其對(duì)肝細(xì)胞損傷作用較小，肝細(xì)胞產(chǎn)率和存活率高，成為了分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法。

原代肝細(xì)胞及其應(yīng)用

原代肝細(xì)胞(Primary hepatocytes)是指從動(dòng)物肝臟直接分離的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是高度分化的細(xì)胞，具有豐富的酶系及多種特異性功能。原代肝細(xì)胞作為一種體外模型，具有其它體外模型不可替代的優(yōu)點(diǎn)：

①與體內(nèi)環(huán)境保持一致，酶量和輔助因子水平都是正常的生理濃度，可以在接近生理狀態(tài)的的情況下研究藥物的代謝和毒性；

②較好保留和維持了肝細(xì)胞的完整形態(tài)和肝細(xì)胞體外代謝活性，真實(shí)反應(yīng)了體內(nèi)的代謝情況；

③無須擔(dān)心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問題，亦可減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需要的的成本開支，實(shí)現(xiàn)了減少（Reduction）、替代（Replacement）、優(yōu)化（Refinement）的3R倫理原則。

  原代肝細(xì)胞作為體外藥物試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)"，廣泛應(yīng)用于藥物代謝與毒理學(xué)等研究中：

  探討藥物在肝中的代謝途徑和藥物藥代動(dòng)力學(xué)的研究；

  評(píng)價(jià)藥物和外源性物質(zhì)對(duì)肝臟中細(xì)胞色素P450酶誘導(dǎo)作用并探討其誘導(dǎo)機(jī)制；

  預(yù)測(cè)和解釋藥物與藥物之間的相互作用；

  研究藥物的細(xì)胞毒性等。

原代肝細(xì)胞分離

原代肝細(xì)胞的分離是肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)的重要基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟，如何獲得高活力、數(shù)量多的肝細(xì)胞，分離技術(shù)是關(guān)鍵的第一步。目前，原代肝細(xì)胞的分離方法有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶離體消化法、兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）等。

【直接剪切法】

原理：用手術(shù)剪或鋒利的刀片將肝臟切成小塊，然后用膠原酶或胰蛋白酶進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，適用于大量細(xì)胞的分離。

缺點(diǎn)：細(xì)胞損傷較大，純度較低。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理：將肝臟組織切成小塊，在培養(yǎng)皿中加入含有特定生長因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，使組織塊貼壁生長，肝細(xì)胞逐漸從組織塊中游離出來。

優(yōu)點(diǎn)：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：肝細(xì)胞密度不易掌控且組織塊能否游離出肝細(xì)胞無法確定。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶對(duì)肝臟進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較為徹-底地分解細(xì)胞間物質(zhì)，獲得較純的肝細(xì)胞。

缺點(diǎn)：胰蛋白酶的價(jià)格較貴，成本較高。

【兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中，使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)分開，然后收集分離出的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠分離出存活率高、形態(tài)好的肝細(xì)胞，適用于長期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣，技術(shù)要求高，成本也相對(duì)較高。

其中，兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）是Seglen于1976年在前人的基礎(chǔ)上改良形成的，它具有分離效果好，細(xì)胞產(chǎn)率高，存活率高，對(duì)細(xì)胞損傷小，細(xì)胞維持肝細(xì)胞特異性功能時(shí)間長等特點(diǎn)，是目前國際上流行的原代肝細(xì)胞分離方法。

兩步膠原酶灌注法先使用無鈣灌注液灌注，無鈣灌注液作為預(yù)灌液，可以將肝臟內(nèi)的殘留血液灌注出，除去或者減少細(xì)胞間的鈣離子，以減少細(xì)胞間的粘著力。之后再使用含膠原酶灌注液進(jìn)行灌注把組織中的細(xì)胞釋放出來。膠原酶在消化肝組織的同時(shí)解除了細(xì)胞間接觸抑制或活化了潛在的蛋白激酶、生長因子或受體，使肝細(xì)胞能逐漸適應(yīng)消化分離過程中所發(fā)生的細(xì)胞、外環(huán)境及細(xì)胞的各種改變，這些改變對(duì)離體肝細(xì)胞修復(fù)、生長及功能有重要的促進(jìn)作用，有利于肝細(xì)胞的培養(yǎng)。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

兩步膠原酶灌流法現(xiàn)已成為分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，繼開發(fā)人、猴、犬、大鼠和小鼠等多種屬原代肝細(xì)胞產(chǎn)品后，又推出基于兩步膠原酶灌流法的不同種屬的原代肝細(xì)胞分離試劑盒。試劑盒提供了用于分離動(dòng)物原代肝細(xì)胞的主要試劑，包括灌流液、膠原酶、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞純化液等，且試劑盒各組成成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

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